DAG 4!!!

Nu har jag gjort de sista delarna av laborationen.

Här kommer mina reflektioner....

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

PCR är en metod som går snabbare än Southern, då Southern innehåller flera steg och dessutom måste provet ligga över natt.

Dock ska man vara medveten om att Southern är mycket mer noggrann. Det syns väldigt tydligt då jag och Emmeli (min laborationspartner) då vår PCR finns med i Southern.

När man endast gjort gelelektrofores på PCR så syns kontamination av positiv och negativ kontroll och tydligt man band vid PCR brunn, där vi antar att gen LL37 ska vandra till. När man gjort hybridisering med probe så syns ingen skillnad mellan brunn innehållande negativ kontroll, positiv kontroll och PCR prov. Man kan tydligen se att proven alla prov innehåller LL37, och den negativa kontrollen var mycket kontimenerad med LL37.   

Gelelktrofores. brunn 1- neg. kontroll. brunn 7 - PCR-prov. brunn 8 - pos. kontroll 

Efter hybridisering med probe. Neg. & pos. kontroll brunn 1,8. PCR-prov brunn 7.

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?

Under laborationerna har vår laborationsgrupp fått arbeta relativt fritt, och på så sätt har man lärt sig hur vi ska planera laborationen, för att slippa onödig väntetid. Det gör att man måste planera laborationerna noggrant om man har steg som måste vila eller ligga i värme i en timme.

Jag har också lärt mig det grundläggande i hur man detektera gener inom molekylärbiologi, och fått en insikt om när man behöver det olika metoderna.  

 

/Nathalie

 

Dag 2

Förra veckan utförde jag en PCR och gelelektrofores. Resultaten av PCR gick inte att tyda då det hände något med gelelektroforesen, som gjorde att den inte gick att avläsa. Då alla band med proverna på agarosgelen försvann efter utförd gelelektrofores.  

Proverna laddades i agarosgelen enligt instruktioner och allt såg bra ut i den första 5-10 minuter. Sedan tog jag och min laborationspartner en rast på 20 min. När vi kom tillbaka var sträcken på agarosgelen borta. Vi belyste agarosgelen i uv-ljus och fotograferade den. På bilden går det att se några otydliga sträck i början av agarosgelen, så proverna hade börjat vandra på gelen med försvunnit.  Detta går att se i blid 1. 

Bild 1

Jag eller min laborationspartner kan komma på vad vi har gjort för fel, men något har helt klart gått fel med gelelektroforesen. Annica och Kristina kunde inte heller avgöra vad som gått fel, och de kan inte ge någon bra förklaring till det som skett.

Det som jag och min laborationspartner får göra är att vi får göra om geleelektroforesen av PCR när vi utför Southern blot för att kontrollera att PCR har gått bra.  

Bild 2

Bild 2 illustrera en gelelektrofores som har gått bra. 

PCR har ej gått perfekt då det finns smear i gelen, vilket tyder på kontaminering av PCR innan amplifiering. Det finns gen LL37 i provet och plasmid preparationen har gått utmärkt.

Brunn 1 – PCR prov  

Brunn 2 – markör IX

Brunn 3 – plasmid  

Brunn 4 – markör III

Brunn 5 – positiv kontroll

Brunn 8 – negativ kontroll

/Nathalie 

DAG 1

I dag har jag renat plasmid från E. colibakterier och kontrollerat renhet och koncentration av plasmid.

Här kommer mina reflektioner runt laborationen.....  

Under vår rening av plasmid enligt Qiagen, så ska plasmiden har bli renat celldebris som kolhydrater, lipider, proteiner och salter. Efter en optimal rening ska endast plasmiden finnas kvar som har funnits i E. coli bakterien.  

När rening var klar fick gjordes en koncentrationsbestämning där man använde spektofotometer för att avläsa absorbansvärdet för att beräkna proteinkoncentration och kontrollera ev. föroreningar m. ha. Kvoten A₂₆₀/A_280.

Plasmidlösningen jag arbetade med har en koncentration på 0,29 µg/µL. Den koncentrationen är bra, då man ska ha en koncentration på plasmidlösningen runt 0,3 µg/µL.

Kvoten A₂₆₀/A₂₈₀ blev 1,81 och det tyder på att plasmidlösningen inte är förorenad. Godkänd kvot låg på mellan 1,6-2,0. Dock ska man vara medveten om att kvoten kan variera mellan flera mätningar då DNA-molekylen är en svårt mätt molekyl. Absorbanskvot för DNA är 1,8. Vilket är värdet vi strävar efter då plasmiden består av DNA. Hade kvoten legat närmre 2,0 kunde det varit ett tecken på att plasmidlösningen innehåller mycket RNA. Hade kvoten varit låg, under 1,6 är det ett tecken på förorening av proteiner eller från buffertarna som användes för rening av plasmid. Absorbanskvot för DNA är 1,8.  

Jag tycker att jag lyckades få en ren plasmid som uppfyller alla krav för fortsatt laboration.

Inför nästa laboration skulle jag vilja ha en liten mer genomgång av vad som kommer ske på denna laborationsdag och kanske någon typ av inplanerad förmiddagsrast och/eller eftermiddagsrast. Framförallt på eftermiddagen var man ganska trött och den hade varit skönt med en kaffepaus. 

/Nathalie