Förra veckan
utförde jag en PCR och gelelektrofores. Resultaten av PCR gick inte att tyda då
det hände något med gelelektroforesen, som gjorde att den inte gick att avläsa.
Då alla band med proverna på agarosgelen försvann efter utförd gelelektrofores.
Proverna
laddades i agarosgelen enligt instruktioner och allt såg bra ut i den första
5-10 minuter. Sedan tog jag och min laborationspartner en rast på 20 min. När
vi kom tillbaka var sträcken på agarosgelen borta. Vi belyste agarosgelen i
uv-ljus och fotograferade den. På bilden går det att se några otydliga sträck i
början av agarosgelen, så proverna hade börjat vandra på gelen med
försvunnit. Detta går att se i blid 1.
 |
| Bild 1 |
Jag
eller min laborationspartner kan komma på vad vi har gjort för fel, men något
har helt klart gått fel med gelelektroforesen. Annica och Kristina kunde inte
heller avgöra vad som gått fel, och de kan inte ge någon bra förklaring till
det som skett.
Det som jag
och min laborationspartner får göra är att vi får göra om geleelektroforesen av
PCR när vi utför Southern blot för att kontrollera att PCR har gått bra.
 |
| Bild 2 |
Bild 2
illustrera en gelelektrofores som har gått bra.
PCR har ej gått perfekt då det
finns smear i gelen, vilket tyder på kontaminering av PCR innan amplifiering. Det
finns gen LL37 i provet och plasmid preparationen har gått utmärkt.
Brunn 1 –
PCR prov
Brunn 2 –
markör IX
Brunn 3 – plasmid
Brunn 4 –
markör III
Brunn 5 –
positiv kontroll
Brunn 8 –
negativ kontroll
/Nathalie
Hej Nathalie!
SvaraRaderaJag vet inte om vi utförde laborationen på samma dag!! Eftersom de andra grupper som utfördes laborationen med oss, de fick samma era resultat, Annica och Kristina sade att felet är på TAE buffert vilken förbereddes för elektrofores, bufferten hade pH värde nästan 4 och det är fel av de som förberedde bufferten. Så var det inte er fel och jag hoppas att ni blir lyckas med nästa laborations dag.
Hej Nathalie!
SvaraRaderaVad synd att det inte gick att läsa PCR resultaten.
Du har en annan bild på elektrofores där det visas att PCR har smear. Du förklarar att det är kontaminering. Då undrar jag, vilken typ av kontaminering?
Lycka till med nästa laborationen.
Diana.
Det var lite mystiskt att ni såg så lite på er gel. Det kan dock inte vara samma fel som den tidigare gruppen hade eftersom ni använde en annan buffert med kontrollerat pH.
SvaraRaderaDu skriver bra om hur du tolkar resultatet från absorbansmätningen.
När du skriver att ni renade plasmiden från celldebris som kolhydrater salter lipider och proteiner, vill jag bara förtydliga att med celldebris menar man större komponenter från cellerna som rester av cellmembran och cellvägg. Sedan är det kanske bra att ta med att man renar från annan nukleinsyra också.
Det ser onekligen lite "smearigt" ut vid PCR-amplifikaten. Detta är dock inte kontamination utan ospecifik amplifiering. Med kontamination menar man att man fått en specifik amplifiering men inte utifrån det templat man tillsatt utan från templat, i detta fall LL37, som kommit någon någon annan källa tex en kontaminerad pipett.
Annica
Hej allihopa ger svar till alla samtidigt.
SvaraRaderaAli vi använde ej samma buffert som ni använde, så vi kan inte säga att det var buffertens fel. Dock kan ni få veta att de var jag som gjorde den felaktiga bufferten tillsammans med Emmeli. Vi läste förmodligen inte på den tris som var framställd/kontrollerade vad den hette. det gjorde att de blev surare än vad den skulle. dessutom kollades inget pH på buffert, vilket man inte skulle göra enligt instruktioner. vilket gjorde att den blev väldigt felaktig.
Diana kontaminering som skriver om återfinns i negativ och positiv kontroll. den beror förmodligen pga att nukletiderna var "gamla" och förmodligen basparade med varandra under pcr. vilket skapade smear.
Annica tack för att förklaring mellan smear och ospecifik amplifierin.